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IHC实验疑难解析大汇总

北京快乐8本周小编将带来IHC系列培训的最后一讲,IHC实验中各种常见问题的原因分析和解决方案。希望通过本次课程,您可以了解到 IHC 实验中出现异常情况时您可采取的措施。

一、切片无染色 

IHC 中可能遇到的一个主要问题是无染色。出现这一问题的原因主要有三个:

  • 蛋白表达量低/无表达 

  • 北京快乐8样本制备不良 

  • 试剂/方案问题 

1、表达量低/无表达

  • 确定目标蛋白的表达量,用工具查询,Uniport官网: https://www.uniprot.org/

  • 北京快乐8了解目标蛋白表达的种属特异性和组织特异性,有时候目标蛋白在一些常见种属(如:人)有表达,并不表示在其他种属上也有表达。

解决方案:

  • 在实验前查询文献,确定您待检测的目标种属和组织的表达量情况

  • http://www。proteinatlas。org/,在这个网站上会提供人体组织的不同蛋白RNA表达数据和IHC数据,可以作为参考;

  • 在实验方案中添加阳性对照组织样本,验证实验体系的正确性;

  • 阳性对照的细胞系,一些情况下,可以选择确定会表达目标蛋白的细胞系作为阳性对照;

  • 质量优良的抗体说明书上会给出建议的阳性对照样本,可以作为参考。

图1、人体不同组织的表达分布,来源:proteinatlas官网

2、样本制备不良

  • 固定步骤:过度固定组织或固定时间不够;固定时使用福尔马林和多聚甲醛固定剂可能会遮蔽抗体识别的表位。

解决方案:

  • 不同的抗原修复方法暴露表位(用 pH 6 或 pH 9 缓冲液热修复、酶修复等)。

  • 如果过度固定,则需要缩短固定时间。

  • 可能脱蜡不充分

解决方案:

  • 延长脱蜡时间,且需要使用新鲜二甲苯

 

图2 、不同修复液对染色效果的影响

3、试剂/方案问题

  • 一抗问题:

  • 浓度太低:按照说明书上的建议,梯度稀释抗体后实验,选择合适的浓度。

  • 孵育时间不够:尝试在 4°C 孵育更长时间(例如过夜)。

  • 抗体可能不适用于IHC应用,因为其可能无法识别蛋白质的天然(3D)构象。

检查抗体数据表,查看其是否在 IHC 中得到了验证及其 IHC 的类型(石蜡切片、冰冻切片等)。抗体在免疫细胞化学(ICC)或免疫沉淀(IP)中的成功使用暗示了抗体能够识别蛋白质的天然构象。  

  • 二抗问题:

  • 使用的二抗为抗一抗宿主的抗体(例如,如果在兔中生产一抗,则使用抗兔二抗)。检查一抗的亚型是否被二抗识别。

  • 用其他蛋白的一抗检测二抗效果,确保二抗正常使用。

二、高背景

免疫组化染色之后的高背景是困扰很多实验者的常见现象,如果您遇到类似问题,可以对照下表的分析,尝试相应的解决方案。

可能的问题原因

解决方案

没有封闭或封闭不足

  • 增加封闭时间,考虑更换封闭剂。如果使用血清,Abcam 推荐使用二抗种属来源的正常血清(10%)封闭 1 小时。

  • 试用商业化封闭缓冲液。

  • 另一种选择是尝试预吸附二抗。

  •  

一抗浓度可能过高

滴定抗体至最佳浓度,进一步稀释抗体并在 4℃ 孵育(缓慢孵育,但有针对性地结合效果最佳)。

 

孵育温度可能过高

  • 4°C 下孵育切片。

  •  

二抗可能是非特异性结合

  • 使用不加一抗只加二抗的对照。

  • 如果您只看到二抗非特异性染色,请更换二抗,或者使用预吸附二抗。

  •  

组织冲洗不充分,仍残留固定剂

  • 所有步骤之间用 PBS 充分冲洗。

  •  

内源性过氧化物酶具有活性

  • 用酶抑制剂,使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制碱性磷酸酶,或用H2O2(0.3% v/v) 抑制过氧化物酶。

  •  

检测系统是荧光显微镜,固定过程引起自发荧光

  • 福尔马林/PFA 通常在绿色光谱中出现自发荧光,因此可试用在红光谱内的荧光基团。

  • 如果您有红外检测系统,可以使用红外范围内的荧光基团。

  •  

信号扩增过多(间接技术)

  • 减少扩增孵育时间,稀释二抗或扩增试剂盒试剂。

  •  

北京快乐8应用过多底物(酶检测)

  • 更大倍数稀释底物,减少底物孵育时间。

  •  

色原与组织样本中PBS 反应(酶检测)

  • 在与底物孵育前使用 Tris 缓冲液清洗切片。

  •  

通透破坏细胞膜并去除膜蛋白(膜蛋白)

  • 更换通透剂(如用 Tween® 20 代替 Triton™ X-100)

  • 北京快乐8使用不含通透剂的缓冲液。

三、非特异性染色

非特异性染色也是小编在日常工作中被问到频率较高的问题,希望下面这些建议一次性解答您的各种疑问。

  • 一抗/二抗浓度可能过高。

    • 尝试降低抗体浓度和/或缩短孵育期。可以与不表达靶蛋白的阴性组织进行比较。

  • 内源性过氧化物酶具有活性。

    • 用酶抑制剂,使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制碱性磷酸酶,或用 H2O2 (0.3% v/v) 抑制过氧化物酶。

  • 一抗是抗染色组织来源物种的抗体(例如在小鼠组织样本上使用小鼠一抗)。当应用二抗时,其与组织样本结合,因为其为抗该种属抗体。

    • 使用的一抗为针对与您组织来源物种不同物种的抗体。

    • 使用商业化试剂盒(例如,mouse on mouse 试剂盒:ab127055)。

  • 切片/细胞已经干燥。

    • 将切片/细胞保持在高湿度下以防变干。

总结

您现在应该已经完全了解了 IHC 的常见疑难问题知识,包括:

1、切片无染色的原因及解决方法;

2、遇到高背景染色结果时的处理方案;

北京快乐83、排除非特异性染色时的做法。

希望您通过这次系列培训了解所有相关实验知识,使您可以顺利完成所有实验。IHC 的培训到这里就结束了。请务必把这些信息保存在安全的地方,以备日后参考。

 

本文内容来源于abcam官网。

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